Aplikasi Kultur Jaringan dalam Produksi Metabolit Sekunder Tumbuhan

 

1.1 Kelebihan Teknik Kultur Jaringan dalam Produksi Metabolit Sekunder Tumbuhan

Minat konsumen terhadap metabolit sekunder tanaman mengalami peningkatan seiring dengan peningkatan permintaan senyawa alami yang aman karena bahan kimia sintetis dianggap berpotensi beracun. Beberapa senyawa tanaman penting dengan struktur kimia sederhana dapat diproduksi melalui kemosintesis; namun, banyak senyawa seperti alkaloid sulit disintesis atau biaya sintesisnya melebihi ketersediaan komersialnya (Greger, 2017). Beberapa senyawa dapat diperoleh dari tanaman yang tumbuh secara alami, tetapi terkadang ada batasan regional dan lingkungan, yang dapat membatasi produksi komersial (Yue et al., 2016). Kultivasi tradisional beberapa spesies tanaman juga sulit atau memakan waktu yang lama hingga beberapa tahun. Dalam konteks ini, teknik kultur sel dan jaringan tanaman muncul sebagai metode alternatif yang ramah lingkungan untuk produksi metabolit sekunder ketika pasokan alami terbatas dan metode tradisional tidak memungkinkan. Perbanyakan massal tanaman dalam kondisi aseptik dan lingkungan terkontrol, dan produksi metabolit sekunder skala besar dalam sistem sepanjang tahun tanpa kendala musim, adalah beberapa keuntungan dari teknik kultur jaringan tanaman (Isah et al., 2018). Selain itu, kultur dapat dilakukan di manapun secara independen dari syarat pertumbuhan tanaman dan bebas dari mikroba dan serangga menghindari penggunaan pestisida dan herbisida (Ochoa-Villarreal et al., 2016). Teknik kultur jaringan tanaman memberikan metode yang andal dan dapat diprediksi untuk mengisolasi metabolit sekunder dengan efisiensi tinggi dalam waktu singkat jika dibandingkan dengan ekstraksi dari populasi tanaman liar. Juga, kesederhanaan dalam ekstraksi metabolit dari jaringan yang diproduksi secara in vitro membuat metode ini menarik untuk aplikasi komersial (Kolewe et al., 2008).

Terlepas dari kelebihan tersebut di atas, ada metabolit yang umumnya tidak ditemukan pada tanaman utuh tetapi dapat diproduksi dengan kultur in vitro (Pavlov et al., 2005). Bioteknologi membuka peluang untuk menerapkan strategi rekayasa tradisional atau metabolik untuk menginduksi akumulasi senyawa yang diinginkan dengan kultur in vitro. Produk dari kultur in vitro masih dapat digunakan sebagai model tanaman utuh, dan kultur sel dapat diberi radiolabel sehingga produk sekunder dapat dilacak secara metabolik (Khani et al., 2012).

Perbanyakan in vitro melalui teknik kultur jaringan tanaman memungkinkan perbanyakan tanaman dalam skala besar dalam waktu singkat dan tanpa dampak negatif terhadap sumber daya alam (Verpoorte et al., 2002). Metode ini sangat berguna untuk tanaman yang sulit diperbanyak dengan teknik konvensional atau dengan kecepatan perbanyakan yang lambat. Dalam konteks ini, dalam beberapa tahun terakhir, telah terjadi peningkatan minat pada penggunaan metodologi ini untuk perbanyakan dan konservasi tanaman obat.

1.2 Sistem Kultur untuk Produksi Metabolit Sekunder

Produksi metabolit sekunder dengan kultur in vitro biasanya terjadi dalam proses dua langkah, akumulasi biomassa dan sintesis metabolit sekunder, di mana kedua langkah perlu dioptimalkan secara independen (Murthy et al., 2014). Produksi dapat dicapai dengan menggunakan kalus yang tidak berdiferensiasi, kultur suspensi sel, atau struktur seperti tunas, akar, atau embrio somatik. Dalam beberapa kasus, tingkat diferensiasi tertentu mungkin diperlukan agar biosintesis terjadi (Karuppusamy, 2009). Penggunaan kultur organ yang berbeda juga diperlukan misalnya ketika metabolit target hanya diproduksi di jaringan atau kelenjar tanaman khusus seperti halnya minyak atsiri (Ramachandra et al., 2002).

Di antara jaringan yang terdiferensiasi, kultur hairy root menawarkan peluang baru untuk produksi in vitro senyawa penting tanaman (Chandra dan Chandra, 2011). Hairy root disebabkan oleh infeksi tanaman dengan Agrobacterium rhizogenes, bakteri tanah Gram-negatif. Selama infeksi, segmen DNA (T-DNA) dari plasmid besar yang menginduksi akar (Ri) bakteri dipindahkan ke dalam genom tanaman yang terinfeksi. Tingkat diferensiasi seluler yang lebih tinggi, pertumbuhan yang cepat, stabilitas genetik dan biokimia, serta fasilitas pemeliharaan merupakan beberapa keunggulan hairy root. Namun, kesulitan dalam menumbuhkan hairy root dalam sistem industri membatasi penggunaan komersialnya untuk menghasilkan metabolit sekunder tanaman yang penting.

Meskipun ada banyak penelitian yang melaporkan produksi metabolit sekunder menggunakan kultur kalus dan jaringan yang berdiferensiasi, dalam banyak kasus, sel yang tidak berdiferensiasi adalah sistem kultur yang banyak disukai (Yue et al., 2016). Kultur suspensi sel adalah metode sederhana dan hemat biaya yang telah banyak digunakan untuk mengatasi masalah produksi skala besar. Sel tumbuhan secara biosintetik totipoten, yang berarti bahwa dalam kondisi yang sesuai, setiap sel secara teoritis memiliki kapasitas untuk menghasilkan senyawa yang identik dengan yang ada pada tanaman induknya. Kultur sel tanaman memiliki potensi yang lebih cepat untuk aplikasi komersial daripada kultur jaringan atau organ (Xu et al., 2011). Kultur sel dianggap sebagai sistem yang stabil untuk produksi metabolit sekunder yang berkelanjutan dengan kualitas dan hasil yang seragam. Keuntungan besar lainnya dari kultur sel tanaman adalah kemungkinan untuk mensintesis produk baru yang biasanya tidak diproduksi oleh tanaman asli (de Pádua et al., 2012). Kultur sel adalah platform bioteknologi yang lebih disukai untuk menghasilkan metabolit sekunder bernilai tinggi, seperti taksol, resveratrol, artemisinin, ginsenosides, dan ajmalisin.

1.3. Strategi untuk Meningkatkan Metabolit Sekunder

Dalam eksploitasi komersial kultur sel tanaman untuk produksi metabolit sekunder bernilai tinggi, sangat penting untuk mencapai hasil tinggi dan produksi yang konsisten. Produksi metabolit sekunder pada tanaman bergantung pada genotipe; dengan demikian, langkah pertama untuk memulai kultur sel atau organ adalah pemilihan tanaman induk yang mengandung kandungan produk sekunder yang lebih tinggi untuk induksi kalus atau organ, dan pemilihan galur sel/organ yang berproduksi tinggi (Murthy et al., 2014). Seleksi dilakukan dengan menganalisis pertumbuhan sel/organ kemudian dengan mengkuantifikasi produk yang diinginkan dengan teknik kromatografi dan spektroskopi. Namun demikian, hanya dengan memilih galur yang sangat produktif, hasil produksi tidak selalu memadai, dan setelah lama proses kultur, tanaman kehilangan efisiensi produksinya. Dengan demikian, banyak strategi alternatif yang dapat digunakan untuk merangsang produksi metabolit sekunder dan memperoleh hasil yang efisien termasuk strategi rekayasa tradisional dan metabolik (Khani et al., 2012).

1.3.1 Strategi Tradisional

Ada beberapa faktor yang dapat dioptimalkan untuk meningkatkan pertumbuhan dan produktivitas metabolit kultur in vitro. Di antaranya adalah: komposisi media kultur, pH media, kepadatan inokulum, lingkungan media kultur (misalnya, suhu, kerapatan dan kualitas cahaya, dll.), agitasi dan aerasi (Ochoa-Villarreal et al., 2016). Media kultur sangat mempengaruhi produktivitas biomassa dan metabolit, dan dengan demikian pemilihan formulasi media kultur yang sesuai merupakan langkah penting. Faktor tersebut harus dipilih sesuai dengan persyaratan fisiologis spesies tanaman, dan ada beberapa parameter yang dapat dioptimalkan, yaitu komposisi nutrisi, kekuatan garam, kadar nitrat dan fosfat, jenis dan konsentrasi zat pengatur tumbuh, sumber karbon. Misalnya , sumber karbon memainkan peran penting dalam sistem transduksi sinyal melalui pengaturan ekspresi gen dan proses perkembangan (Isah et al., 2018).

Metabolit sekunder diproduksi oleh sel tumbuhan sebagai respons terhadap rangsangan lingkungan atau sebagai mekanisme pertahanan melawan patogen yang menyerang. Dalam pengertian ini, strategi yang tersedia untuk meningkatkan produktivitas metabolit sekunder yaitu elisitasi, bertujuan untuk mengarahkan sel atau jaringan menuju respons berkaitan dengan serangan biotik/abiotik dengan menggunakan agen yang memicu respons pertahanan (Vickers, 2017). Elisitor memiliki kemampuan untuk mengontrol berbagai aktivitas seluler pada tingkat biokimia dan molekuler karena menginduksi upregulasi gen. Elisitor dapat berupa biotik atau abiotik dan dapat terdiri dari molekul sinyal seperti metil jasmonat, asam salisilat, ekstrak dinding sel mikroba (misalnya, ekstrak ragi, kitosan), garam anorganik, logam berat, agen fisik (misalnya, radiasi UV) (Ramirez-Estrada et al., 2016). Metil jasmonat dan molekul sinyal terkaitnya, dan asam salisilat mungkin merupakan elisitor yang paling banyak digunakan (Giri dan Zaheer, 2016). Kombinasi beberapa elisitor dengan faktor fisik (misalnya, sinar UV, rezim suhu, dan medan listrik) menghasilkan hasil yang baik untuk produksi metabolit sekunder (Saw et al., 2012). Kultur suspensi sel adalah sistem kultur yang paling banyak digunakan untuk perlakuan elisitasi dan produksi metabolit sekunder.

Pemberian nutrisi dan prekursor juga digunakan untuk meningkatkan hasil produksi metabolit sekunder. Pemberian nutrisi melibatkan pemberian kembali media nutrisi, dan dalam pemberian prekursor, kultur sel tanaman digunakan untuk mengubah prekursor menjadi produk dengan memanfaatkan sistem enzim yang sudah ada sebelumnya. Imobilisasi sel tumbuhan adalah strategi lain yang digunakan untuk mengatasi masalah agregasi sel. Dalam teknik ini, sel-sel dimasukkan dalam gel tertentu atau kombinasi gel. Contoh matriks yang digunakan adalah kalsium alginat (paling banyak digunakan), agarosa, gelatin, karagenan, atau poliakrilamida. Strategi ini memiliki beberapa keuntungan, seperti perpanjangan viabilitas sel pada tahap stasioner, penyederhanaan pemrosesan, kepadatan sel yang tinggi dalam bioreaktor kecil, mengurangi biaya dan risiko kontaminasi, peningkatan akumulasi produk, dan minimalisasi cairan viskositas.

1.3.2 Rekayasa Metabolik

Rekayasa metabolisme menawarkan perspektif baru untuk memahami ekspresi gen yang terlibat dalam biosintesis metabolit sekunder melalui studi over-ekspresi yang memungkinkan perubahan jalur biosintesis (O'Connor, 2015). Hal ini melibatkan studi reaksi enzimatik dan proses biosintetik pada tingkat gen, transkriptomik, dan proteomik, dan manipulasi gen yang mengkode enzim kritis dan pembatas laju dalam jalur biosintetik (Lu et al., 2016). Secara teoritis, produktivitas metabolit sekunder kultur sel tanaman dapat ditingkatkan melalui over-ekspresi dari gen yang mengkode enzim pengatur yang terlibat dalam jalur biosintesisnya. Namun, over-ekspresi dari gen tertentu mungkin tidak selalu meningkatkan produksi (Verpoorte et al., 2002).

Pendekatan rekayasa metabolik juga menggunakan penghambatan jalur kompetitif untuk meningkatkan fluks metabolisme intermediet jalur biosintetik yang ditargetkan untuk produksi yang lebih tinggi melalui berbagai pendekatan. Langkah-langkah tertentu dalam jalur biosintetik dapat dihambat untuk menginduksi akumulasi zat antara sebelumnya. Pemahaman jalur biosintesis fenilpropanoil yang terlibat dalam biosintesis beberapa metabolit sekunder tanaman adalah aplikasi yang paling sukses dan terbaru.

Pemahaman mendalam tentang jalur biosintetik masih menjadi penghalang untuk penggunaan praktis dari strategi ini untuk meningkatkan produksi (Oksman-Caldentey dan Arroo, 2000). Untuk produksi metabolit sekunder penting dalam skala besar untuk memenuhi permintaan industri, diperlukan lebih banyak penelitian untuk mengidentifikasi langkah-langkah dan regulasi yang membatasi laju biosintetiknya.

1.4 Produksi Skala Besar

Peningkatan skala melibatkan penggunaan bioreaktor dengan berbagai ukuran dan fitur, dan kultur suspensi sel adalah sistem kultur yang lebih baik yang memiliki beberapa keunggulan dibandingkan dengan yang lain. Kesederhanaan, prediktabilitas, dan efisiensi tinggi di mana metabolit dapat diisolasi dari biomassa atau media budidaya adalah beberapa keuntungan ini. Namun demikian, ada beberapa contoh penggunaan jaringan yang berbeda seperti tunas dan embrio somatik.

Beberapa tonggak penting dalam produksi metabolit sekunder oleh kultur sel tanaman adalah produksi shikonin, dan contoh paling sukses dari proses peningkatan skala mungkin adalah produksi taksol oleh Phyton Biotech Company (Jerman). Phyton Biotech mengoperasikan fasilitas kultur sel tanaman cGMP terbesar di dunia yang dirancang untuk produksi Taxanes skala besar di 75.000 bioreaktor ukuran L yang beroperasi hingga 880.000 L per tahun (Yesil-Celiktas et al., 2010). Berberin, ginsenosides, shikonin, skopolamin, dan asam rosmarinic juga merupakan contoh metabolit sekunder tanaman yang saat ini diproduksi pada skala komersial (Kolewe et al., 2008). Beberapa faktor yang harus dipertimbangkan dalam meningkatkan produksi metabolit sekunder menggunakan bioreaktor, yaitu optimalisasi kondisi kultur, pengukuran produksi biomassa (terutama dengan kultur jaringan dan organ) (Stewart dan Kane., 2006).